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完整線粒體DNA提取神器—SageHLS




有關線粒體︰

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線粒體是一種存在于大多數細胞中的由兩層膜包被的細胞器,細胞中制造能量的結構,是細胞進行有氧呼吸的主要場所。線粒體病是遺傳缺陷引起線粒體異常,致使ATP合成障礙、能量來源不足等導致的一組異質性病變,又稱為線粒體細胞病。常見的線粒體疾病有Leber遺傳性視神經病變(LHON)、線粒體腦肌病合並乳酸血征及卒中發作(MELAS)綜合征、肌陣攣性癲癇伴肌陣攣破裂紅縴維(MERRF)綜合征、母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征等,線粒體疾病發病率約為1:5000(約每5000人中1人發病)。不同物種的線粒體基因組(mtDNA)大小有差異,動物線粒體基因組DNA較小,約為15.7~19.5kb,人類的mtDNA大小為16.659Kb。


線粒體DNA測序現狀&難點︰

mtDNA的突變會產生多種與腦和肌肉組織能量缺陷相關的遺傳因素。mtDNA突變的診斷在以下幾個方面依然面臨著巨大的挑戰︰
1.總量低︰盡管每個哺乳動物細胞有成千上百個mtDNA(每個細胞約300-1000個mtDNA),但是mtDNA基因組非常小(16,659bp,環狀),僅佔細胞內總DNA含量的0.2%。
2.低拷貝數和分布特異性︰對比核基因突變的高拷貝,線粒體蛋白突變通常在每個(雜合或純合)細胞中只有1-2個拷貝,mtDNA突變僅存在于極小部分的mtDNA分子中。此外,與人類疾病相關的mtDNA突變的分布往往具有組織特異性。
3.同源核假基因干擾mtDNA基因中存在一些核假基因,這些假基因與mtDNA的編碼部分具有高度序列同源性。這些假基因的序列讀取使mtDNA突變位點的檢測更加復雜化。



使用SageHLS平台進行完整mtDNA富集
 

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為了確保低豐度mtDNA突變的檢測不受核假基因的干擾,許多研究人員采用傳統的氯化銫密度梯度離心法來富集mtDNA,或在NGS二代測序前通過PCR富集特異性的mtDNA序列,該方法雖然是mtDNA富集的金標準,但是整個富集流程所需試劑多,操作繁瑣且耗時。Sage Science公司推出的SageHLS全自動大片段DNA回收儀展示了一種新的分離mtDNA的方法(如圖1),提供與梯度離心相當的富集得率,且手工操作的時間顯著低于密度梯度離心法。
 

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圖1︰SageHLS一步法提取完整人源mtDNA,取代傳統的氯化銫密度梯度離心分離


結果展示︰

SageHLS只需通過一個步驟,就可富集得到mtDNA。整個工作流程完全自動化,僅包含1.25小時的提取和片段分離電泳,以及1.5小時的洗脫。提取結果由illumina和ONT兩大測序平台進行測序分析後,結果顯示(如圖2),大部分的二代測序突變結果會在三代測序結果上證實。但是,部分三代測序測得的突變未在二代測序結果中檢出。

 

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圖2︰上部分是ONT MinION測序的結果,下圖是illumina MiSeq測序的結果


結果表明︰SageHLS可以用來富集完整的人源mtDNA,文中我們采用簡單易分離的WBC(白細胞)作為上樣樣本,使用SageHLS進行mtDNA純化的過程是完全自動化的,可獲得與繁瑣耗時的金標準——氯化銫密度梯度離心法同樣純度等級的mtDNA。SageHLS富集得到的mtDNA濃度和純度完全符合Illumima測序平台對mtDNA樣本的需求,同時也能對佔比很低的罕見異質性的mtDNA變異位點進行檢測。另外,隨著單分子平台投入成本的降低(Oxford Nanopore和PacBio),我們的方法對于制備這些平台所需的mtDNA是很有用的,將有助于較大的插入、缺失和重排的檢出。


SageHLS功能簡介︰

SageHLS是一款專用于DNA大片段回收的設備。除了可以提取完整mtDNA(下圖),還可以完成靶向大片段DNA的捕獲(上圖),以及HMW高分子量基因組DNA的回收(50Kb-2Mb)。
 

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manbet時時彩生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區的獨家代理商,自2011年以來將Sage Science的產品線引入國內,一直為國內用戶提供專業的全自動核酸片段回收系統的安裝測試、應用培訓,技術支持與售後維護工作,贏得客戶的一致好評與信任。manbet時時彩生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。




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